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求助Real-Time PCR的详细步骤及注意事项

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。主要实验步骤如下：

1.设计并合成RealtimePCR引物。

2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR®Green）的PCR反应的优化。

3.样品RNA抽提a．实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。b．实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。

4.RNA质量检测a．紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。b．使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

5.使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。

6.制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTimePCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTimePCR扩增和检测8.检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。

转基因生物是否会对非目的昆虫产生威胁

转基因生物可能对非目的昆虫产生威胁，主要取决于转基因生物所携带的基因以及转基因生物与非目的昆虫之间的生态关系。以下是一些具体例子：

1. 植物转基因抗虫蛋白：某些转基因玉米和棉花植株携带了Bt毒素基因，这种毒素可以杀死玉米螟等害虫，从而减少植物的损失。然而，很多科学家和环保组织担心Bt毒素可能会对其他的非目的昆虫、特别是蝴蝶、蜜蜂等有益昆虫造成伤害。

2. 生防性病毒：某些转基因植物携带了生防性病毒基因，可以对某些病害进行预防和治疗。然而，这些病毒有时会误伤一些非目的性昆虫，如蚜虫、蜜虫等。

3. 干扰RNA基因沉默技术：干扰RNA（siRNA）是一种沉默某个基因表达的蛋白质。某些转基因植物通过siRNA技术来攻击昆虫，从而控制它们的数量。有些科学家认为，转基因植物中的siRNA可能会干扰一些非目的性昆虫的生长发育和生殖能力。

总之，转基因生物对非目的昆虫产生的威胁需要进行复杂的评估和监测，以确保转基因生物对环境的影响不超出可控范围，并确保生态系统的平衡。